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连接子是用来把细胞毒性药物连接至抗体的化学分子，它的物理化学特点很大程度上决定了一个ADC药物的药代动力学。有效的连接子能平衡循环中药物的稳定性和在目标细胞中的有效释放。设计上有多种策略能加强药物的可溶性和DAR指数，用来克服转运蛋白对化疗药物产生的耐药性，比如MDR1。这些策略包括有条件的在细胞液中释放负载药物，增强旁观者效应（通过非极化连接子-药物代谢产物，使细胞毒药物代谢物能穿透生物膜），限制旁观者效应（通过带电荷的连接子-药物代谢产物，使细胞毒药物代谢物不能穿透生物膜）。

连接子分为可分解（cleavable）和不可分解（non-cleavable）两种。连接子在设计上要求能使ADC药物在循环中很稳定，不释放药物，一旦到达细胞内的靶点，就会释放细胞毒性药物。这两种连接子都被用在第二代和第三代ADC药物的研发上。

2.1.可分解连接子（Cleavable Linkers）

2.1.1 酸性敏感连接子酸性敏感腙基团（化学结构见下图），连接子在循环（pH7.5）中稳定，到了溶酶体（pH4.8）和内吞体（pH5-6）后在酸性的微环境中分解。这些连接子是非特异性（nonspecific）的释放。2010年被撤出市场的gemtuzumab ozogamicin（developer Pfizer）就是用这种连接子。milatuzumab doxorubicin(also known as IMMU-115; developed by Immunomedics，stopped)和inotuzumab ozogamicin（developer Pfizer，临床前）中的连接子就能被低pH值环境水解）。但由于这类连接子可能在循环中有非特异性释放，所以不少临床试验因此而停止了。

2.1.2 谷光苷肽敏感性二硫键它能被谷胱甘肽还原，在肿瘤细胞内因为氧化应激，硫醇基团明显增多，从而导致肿瘤细胞内和细胞外谷胱甘肽的浓度明显不同，这样ADCs药物进入细胞内时，双硫键就能断裂，除了谷胱甘肽，细胞内的蛋白双硫键异构酶（protein disulfide isomerase PDI)也能分解双硫键。美登木素生物碱药物广泛的使用这种连接子，平均的DAR在3-4左右。空间结构的双硫键桥能限制药物在细胞内被提早释放，这些双硫键起初被裂解成硫化的DM4，然后再在细胞甲基转移酶的作用下S-甲基化，才能起作用。比如ADC药物lorvotuzumab mertansine（developer ImmunoGen）, coltuximab ravtansine（developer ImmunoGen） 和 anetumab ravtansine（developer Bayer）。

2.1.3 溶酶体蛋白酶敏感的肽连接子肿瘤细胞中的溶酶体能表达高于正常的cathepsin B蛋白酶，这些蛋白酶在循环中由于高pH值和蛋白酶抑制剂，是没有活性的。这使得这种连接子在循环中能很稳定的存在，只在进入细胞内溶酶体内，连接子才能被分解，被FDA批准的Adecetris（brentuximab vedotin developer Seattle Genetics\/Takeda）的连接子就是cathepsinB敏感的缬氨酸-瓜氨酸连接子（Valine-Citrulline）。Adecetris在后面被批准用于多个适应症，而且都是1线用药，证明此ADC药物的各个属性非常不错。（Adecetris结构见下图，Warhead为monomethyl auristatin E MMAE）

2.1.4 β-葡糖苷酸连接子（β-Glucuronidase-sensitive linkers）β-葡萄糖醛酸酶敏感的连接子已被用于不少葡糖苷酸的前药，溶酶体和肿瘤坏死区域富含β-葡萄糖醛酸酶，这种酶在溶酶体酸性环境中具有活性，而在生理状态下的pH值没有活性。β-葡萄糖醛酸酶能把β-葡萄糖醛酸酶敏感的β-葡糖苷酸的糖苷键分解。而且这种连接子有亲水性，能用于疏水性的负载药物，用来降低ADCs药物的凝聚。

2.2.不可分解连接子 （Non-Cleavable Linkers）

相对于可分解连接子，含有不可分解的硫醚连接子的ADCs在血浆中有更好的稳定性，非特异性的药物释放也较少。连接子通过非还原化学键连接至抗体的氨基酸残基上，内吞后，ADCs药物在溶酶体被降解成药物-连接子-氨基酸残基（drug-linker-amino acid residue）发挥杀伤作用。被批准的药物trastuzumab emtansine (Kadcyla\/T-DM1)，使用的是不可分解的SMCC(N-succinimidyl-4-(maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)连接子（见下图左），在溶酶体被裂解成lysine-MCC–DM1具有细胞杀伤作用，lysine-MCC–DM1由于疏水性不能作用于肿瘤旁的细胞，因此没有旁观者效应。当DM1使用四聚体PEG4Mal（见下图右）连接子时，极性增加，对于MDR1阳性的肿瘤细胞，杀伤力更好。再如，马来酰亚胺基己酸（maleimidocaproic acid）连接子（mc–MMAF），被用在depatuxizumab mafodotin上，最后被代谢成cysteine-mc–MMAF而发挥作用，也被证明有更高的效能，循环中的稳定性更高。

2.3调控旁观者效应在ADC药物中发挥的作用

实体瘤能表达异质性的抗原，ADCs药物能选择性的杀灭抗体阳性的肿瘤细胞，同时对周围抗原阴性的肿瘤细胞不能起到很好的杀伤作用，因此ADCs药物也许可以设计成不仅能杀死抗原阳性的肿瘤细胞，同时不管周围的肿瘤细胞抗原表达是否阳性，也能杀灭，这就是“旁观者效应（bystander effect）”。先简单看下ADC药物内吞及细胞内杀伤机制。ADC药物胞转运过程经典模型及旁观者效应，见下图。

从图中可以看到，ADC药物先与细胞膜上的抗体相结合，然后抗体抗原复合物通过细胞内吞作用进入细胞内，并形成内含体，随后内含体进一步成熟并融合成溶酶体，在溶酶体内，细胞毒药物被释放（通过与之相对应的特异性蛋白酶分解连接子，如组织蛋白酶B（cathepsin B），或者整个ADC药物在溶酶体被分解），产生的细胞毒药物穿透溶酶体膜，绑定至DNA或者微管导致细胞凋亡。这些药物也可以通过细胞膜上的蛋白转运泵出至肿瘤微环境，进入到相邻的肿瘤细胞上，对其产生杀伤作用，这就导致了“旁观者效应（Bystander Effect）”。相邻的肿瘤细胞可以为细胞表面抗原阴性的肿瘤细胞，这样旁观者效应就会对抗原阴性的肿瘤也产生杀伤作用。这种旁观者效应在设计ADC药物时，也越来越多的被考虑，因为这只要求肿瘤中一部分细胞携带目标抗原即可达到对抗原表达阴性肿瘤细胞的杀伤作用。

比如像brentuximab vedotin（marketed as Adcetris, developer Seattle Genetics），被裂解后释放MMAE，MMAE能够穿过细胞膜杀伤相邻的上皮细胞。与之相反的，denintuzumab mafodotin（developer Seattle Genetics），连接的细胞毒药物为MMAF，裂解后的细胞毒药物代谢物有羧基端的苯基丙氨酸残留，这种代谢后的产物不能穿透生物膜，因此，相对于MMAE产生很少的旁观者效应。所以虽然单独的MMAF的细胞毒性比MMAE要强，但做成ADC药物后，由于有旁观者效应，ADC药物的实际细胞毒性会变得有所不同。同样的，可还原的双硫键有旁观者细胞毒效应，而非还原性硫醚连接子没有旁观者细胞毒效应（比如trastuzumab emtansine）。